人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥亞株(A549/DDP)介紹：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥亞株(A549/DDP)是用藥物劑量增選法篩選獲得的A549 細(xì)胞耐藥亞株。。

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥亞株(A549/DDP)特性：

1） 來源：肺癌

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

3） 含量：>1x106 個(gè)/mL

4） 污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性

5） 規(guī)格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

運(yùn)輸和保存：使用含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的2ml 凍存管發(fā)送存活細(xì)胞。收到細(xì)胞后，可在1000RPM，常溫條件下，離心5min 后，于潔凈操作臺(tái)棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至10cm 培養(yǎng)皿或者T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥亞株(A549/DDP)用途：僅供科研使用。

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥亞株(A549/DDP)培養(yǎng)步驟：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

注意：客戶收到細(xì)胞后按照下面的要求操作：培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)液是不含藥物的。待細(xì)胞長(zhǎng)到70-80%的匯合度時(shí)，去掉培養(yǎng)液，加入含500ng/ml DDP 藥物的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱，這段時(shí)間肯定會(huì)有小部分細(xì)胞懸浮起來，但是不要緊，通過換液可以去掉，下面的細(xì)胞待長(zhǎng)滿就可以消化傳瓶了，這時(shí)可以一直用含藥培養(yǎng)液來消化培養(yǎng)細(xì)胞，一兩代之后可以將藥物濃度提高到800ng/ml，含藥培養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)都沒問題的，凍存的時(shí)候就不要在凍存液里面加藥物了。

1）準(zhǔn)備1640 培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,貨號(hào)21875-091)，90%；北美胎牛血清，10%，添加800ng/ml DDP。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)?span lang="EN-US">細(xì)胞懸液加入10cm 皿中，加入約8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞1-2 次。

2. 加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml 含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO 后進(jìn)行凍存。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。